Heterogenitas serat otot rangka manungsa ngluwihi rantai berat miosin

Matur nuwun sampun ngunjungi nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake nggunakake versi browser paling anyar (utawa mateni mode kompatibilitas ing Internet Explorer). Kajaba iku, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, situs iki bakal bebas saka gaya lan JavaScript.
Otot rangka iku jaringan heterogen sing kasusun utamane saka miofibril, sing ing manungsa biasane diklasifikasikake dadi telung jinis: siji "alon" (tipe 1) lan loro "cepet" (tipe 2A lan 2X). Nanging, heterogenitas antarane lan ing jinis miofibril tradisional isih kurang dingerteni. Kita ngetrapake pendekatan transkriptomik lan proteomik kanggo 1050 lan 1038 miofibril individu saka vastus lateralis manungsa. Panliten proteomik kalebu pria, lan panliten transkriptomik kalebu 10 pria lan 2 wanita. Saliyane isoform rantai berat miosin, kita ngidentifikasi protein metabolik, protein ribosom, lan protein junctional seluler minangka sumber variabilitas intermiofibril multidimensi. Salajengipun, sanajan identifikasi kluster serat alon lan cepet, data kita nuduhake yen serat tipe 2X ora bisa dibedakake kanthi fenotip saka serat kedutan cepet liyane. Salajengipun, klasifikasi adhedhasar rantai berat miosin ora cukup kanggo njlentrehake fenotipe miofibril ing miopati nemalin. Sakabèhé, data kita nuduhaké heterogenitas miofiber multidimensi, kanthi sumber variasi ngluwihi isoform rantai berat miosin.
Heterogenitas seluler minangka fitur sing ana ing kabeh sistem biologis, sing ngidini sel kanggo spesialisasi kanggo nyukupi kabutuhan jaringan lan sel sing beda-beda.1 Pandangan tradisional babagan heterogenitas serat otot rangka yaiku neuron motor nemtokake jinis serat ing unit motor, lan jinis serat (yaiku, tipe 1, tipe 2A, lan tipe 2X ing manungsa) ditemtokake dening karakteristik isoform rantai berat miosin (MYH).2 Iki wiwitane adhedhasar ketidakstabilan pH ATPase,3,4 lan mengko babagan ekspresi molekuler MYH.5 Nanging, kanthi identifikasi lan panrima serat "campuran" sing ngekspresikake pirang-pirang MYH kanthi proporsi sing beda-beda, serat otot rangka saya dideleng minangka kontinum tinimbang minangka jinis serat sing beda.6 Senadyan mangkono, lapangan kasebut isih gumantung banget marang MYH minangka klasifikasi utama kanggo klasifikasi miofiber, pandangan sing bisa uga dipengaruhi dening watesan lan bias sing signifikan saka studi tikus awal sing profil ekspresi MYH lan macem-macem jinis serat beda karo sing ana ing manungsa.2 Kahanan iki luwih rumit amarga kasunyatan manawa otot rangka manungsa sing beda-beda nuduhake macem-macem jinis serat.7 Vastus lateralis kuwi otot campuran kanthi profil ekspresi MYH menengah (lan mulane representatif).7 Salajengipun, gampangipun sampling ndadosaken otot punika paling kathah dipunsinaoni ing manungsa.
Dadi, investigasi sing ora bias babagan keragaman serat otot rangka nggunakake alat "omics" sing kuat iku penting nanging uga tantangan, sebagian amarga sifat multinukleasi serat otot rangka. Nanging, teknologi transkriptomik8,9 lan proteomik10 wis ngalami revolusi sensitivitas ing taun-taun pungkasan amarga macem-macem kemajuan teknologi, sing ngidini analisis otot rangka kanthi resolusi serat tunggal. Akibate, kemajuan sing signifikan wis digawe kanggo nggambarake keragaman serat tunggal lan respon kanggo rangsangan atrofi lan penuaan11,12,13,14,15,16,17,18. Sing penting, kemajuan teknologi iki duwe aplikasi klinis, sing ngidini karakterisasi disregulasi sing ana gandhengane karo penyakit sing luwih rinci lan tepat. Contone, patofisiologi miopati nemalin, salah sawijining penyakit otot turunan sing paling umum (MIM 605355 lan MIM 161800), kompleks lan mbingungake.19,20 Mulane, karakterisasi disregulasi serat otot rangka sing luwih apik bisa nyebabake kemajuan sing signifikan ing pangerten kita babagan penyakit iki.
Kita ngembangake metode kanggo analisis transkriptomik lan proteomik saka serat otot rangka tunggal sing diisolasi kanthi manual saka spesimen biopsi manungsa lan ngetrapake menyang ewonan serat, sing ngidini kita nyelidiki heterogenitas seluler serat otot rangka manungsa. Sajrone karya iki, kita nduduhake kekuwatan fenotipe transkriptomik lan proteomik serat otot lan ngidentifikasi protein junctional metabolik, ribosom, lan seluler minangka sumber variabilitas interfiber sing signifikan. Salajengipun, nggunakake alur kerja proteomik iki, kita njlentrehake relevansi klinis miopati nematoda ing serat otot rangka tunggal, sing nuduhake owah-owahan sing terkoordinasi menyang serat non-oksidatif sing ora gumantung saka jinis serat adhedhasar MYH.
Kanggo nyelidiki heterogenitas serat otot rangka manungsa, kita ngembangake rong alur kerja kanggo ngaktifake analisis transkriptom lan proteom saka serat otot rangka tunggal (Gambar 1A lan Gambar Tambahan 1A). Kita ngembangake lan ngoptimalake sawetara langkah metodologis, saka panyimpenan sampel lan pengawetan integritas RNA lan protein nganti ngoptimalake throughput kanggo saben pendekatan. Kanggo analisis transkriptom, iki ditindakake kanthi nyisipake barcode molekuler khusus sampel ing langkah awal transkripsi terbalik, sing ngidini 96 serat dikumpulake kanggo pangolahan hilir sing efisien. Urutan sing luwih jero (± 1 yuta maca saben serat) dibandhingake karo pendekatan sel tunggal tradisional luwih ngayaake data transkriptom. 21 Kanggo proteomik, kita nggunakake gradien kromatografi cendhak (21 menit) sing digabungake karo akuisisi data DIA-PASEF ing spektrometer massa timsTOF kanggo ngoptimalake ambane proteom nalika njaga throughput sing dhuwur. 22,23 Kanggo nyelidiki heterogenitas serat otot rangka sing sehat, kita njlentrehake transkriptom saka 1.050 serat individu saka 14 donor diwasa sing sehat lan proteom saka 1.038 serat saka 5 donor diwasa sing sehat (Tabel Tambahan 1). Ing makalah iki, set data iki diarani transkriptom lan proteom 1.000 serat. Pendekatan kita ndeteksi total 27.237 transkrip lan 2.983 protein ing analisis transkriptomik lan proteomik 1.000 serat (Gambar 1A, Set Data Tambahan 1-2). Sawise nyaring set data transkriptomik lan proteomik kanggo >1.000 gen sing dideteksi lan 50% nilai valid saben serat, analisis bioinformatika sabanjure ditindakake kanggo 925 lan 974 serat ing transkriptom lan proteom. Sawise nyaring, rata-rata 4257 ± 1557 gen lan 2015 ± 234 protein (rata-rata ± SD) dideteksi saben serat, kanthi variabilitas antar-individu sing winates (Gambar Tambahan 1B–C, Set Data Tambahan 3–4). Nanging, variabilitas ing antarane subjek luwih jelas ing antarane peserta, kemungkinan amarga beda ing asil RNA/protein antarane serat sing dawane beda lan area penampang sing beda. Kanggo umume protein (>2000), koefisien variasi ana ing ngisor 20% (Gambar Tambahan 1D). Kaloro metode kasebut ngidini njupuk rentang dinamis transkrip lan protein sing amba kanthi tandha sing diekspresikan kanthi dhuwur sing penting kanggo kontraksi otot (contone, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Gambar Tambahan 1E–F). Umume fitur sing diidentifikasi umum antarane set data transkriptomik lan proteomik (Gambar Tambahan 1G), lan intensitas UMI/LFQ rata-rata saka fitur kasebut berkorelasi kanthi cukup apik (r = 0,52) (Gambar Tambahan 1H).
Alur kerja transkriptomik lan proteomik (digawe nganggo BioRender.com). Kurva rentang dinamis BD kanggo MYH7, MYH2, lan MYH1, lan ambang batas sing diitung kanggo penetapan jinis serat. E, F Distribusi ekspresi MYH ing antarane serat ing set data transkriptomik lan proteomik. G, H Plot Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) kanggo transkriptomik lan proteomik sing diwarnai miturut jinis serat adhedhasar MYH. I, J Plot fitur sing nuduhake ekspresi MYH7, MYH2, lan MYH1 ing set data transkriptomik lan proteomik.
Wiwitane, kita nemtokake jinis serat adhedhasar MYH kanggo saben serat nggunakake pendekatan sing dioptimalake sing njupuk kauntungan saka sensitivitas dhuwur lan rentang dinamis ekspresi MYH ing set data omics. Panliten sadurunge wis nggunakake ambang batas sing sewenang-wenang kanggo menehi label serat minangka tipe murni 1, tipe 2A, tipe 2X, utawa campuran adhedhasar persentase tetep ekspresi MYH sing beda-beda11,14,24. Kita nggunakake pendekatan sing beda ing ngendi ekspresi saben serat diurutake miturut MYH sing digunakake kanggo ngetik serat: MYH7, MYH2, lan MYH1, sing cocog karo serat tipe 1, tipe 2A, lan tipe 2X. Banjur kita ngetung kanthi matematis titik infleksi ngisor saka saben kurva sing diasilake lan digunakake minangka ambang batas kanggo nemtokake serat minangka positif (ndhuwur ambang batas) utawa negatif (ngisor ambang batas) kanggo saben MYH (Gambar 1B–D). Data kasebut nuduhake yen MYH7 (Gambar 1B) lan MYH2 (Gambar 1C) duwe profil ekspresi on/off sing luwih jelas ing tingkat RNA dibandhingake karo tingkat protein. Pancen, ing tingkat protein, mung sithik serat sing ora ngekspresikake MYH7, lan ora ana serat sing duwe ekspresi MYH2 100%. Sabanjure, kita nggunakake ambang ekspresi sing wis ditemtokake kanggo menehi jinis serat adhedhasar MYH menyang kabeh serat ing saben set data. Contone, serat MYH7+/MYH2-/MYH1- ditugasake menyang tipe 1, dene serat MYH7-/MYH2+/MYH1+ ditugasake menyang tipe campuran 2A/2X (waca Tabel Tambahan 2 kanggo katrangan lengkap). Nggabungake kabeh serat, kita mirsani distribusi jinis serat adhedhasar MYH sing meh padha ing tingkat RNA (Gambar 1E) lan protein (Gambar 1F), dene komposisi relatif jinis serat adhedhasar MYH beda-beda ing antarane individu, kaya sing dikarepake (Gambar Tambahan 2A). Umume serat diklasifikasikake minangka tipe 1 murni (34–35%) utawa tipe 2A (36–38%), sanajan akeh serat tipe campuran 2A/2X uga dideteksi (16–19%). Bentenane sing narik kawigaten yaiku serat tipe 2X murni mung bisa dideteksi ing tingkat RNA, nanging ora ing tingkat protein, sing nuduhake yen ekspresi MYH sing cepet paling ora sebagian diatur sacara pasca-transkripsi.
Kita ngvalidasi metode pengetikan serat MYH berbasis proteomik nggunakake dot blotting berbasis antibodi, lan kaloro metode kasebut entuk persetujuan 100% kanggo ngenali serat tipe 1 lan tipe 2A murni (waca Gambar Tambahan 2B). Nanging, pendekatan berbasis proteomik luwih sensitif, luwih efisien kanggo ngenali serat campuran, lan ngukur proporsi saben gen MYH ing saben serat. Data kasebut nduduhake efektifitas nggunakake pendekatan berbasis omics sing objektif lan sensitif banget kanggo menehi ciri jinis serat otot rangka.
Banjur kita nggunakake informasi gabungan sing diwenehake dening transkriptomik lan proteomik kanggo nglasifikasikake miofiber kanthi objektif adhedhasar transkriptom utawa proteom lengkap. Nggunakake metode pendekatan lan proyeksi manifold seragam (UMAP) kanggo nyuda dimensi dadi enem komponen utama (Gambar Tambahan 3A-B), kita bisa nggambarake variabilitas miofiber ing transkriptom (Gambar 1G) lan proteom (Gambar 1H). Khususé, miofiber ora dikelompokake miturut peserta (Gambar Tambahan 3C-D) utawa dina uji coba (Gambar Tambahan 3E) ing set data transkriptomik utawa proteomik, sing nuduhake manawa variabilitas ing antarane subjek ing serat otot rangka luwih dhuwur tinimbang variabilitas antarane subjek. Ing plot UMAP, rong kluster sing béda sing makili miofiber "cepet" lan "alon" muncul (Gambar 1G-H). Miofiber MYH7+ (alon) dikluster ing kutub positif UMAP1, dene miofiber MYH2+ lan MYH1+ (cepet) dikluster ing kutub negatif UMAP1 (Gambar 1I–J). Nanging, ora ana bedane antarane jinis serat kedutan cepet (yaiku, tipe 2A, tipe 2X, utawa campuran 2A/2X) adhedhasar ekspresi MYH, sing nuduhake yen MYH1 (Gambar 1I–J) utawa penanda miofiber 2X klasik liyane kayata ACTN3 utawa MYLK2 (Gambar Tambahan 4A–B) ora mbedakake antarane jinis miofiber sing beda nalika nimbang kabeh transkriptom utawa proteom. Kajaba iku, dibandhingake karo MYH2 lan MYH7, sawetara transkrip utawa protein sing berkorelasi positif karo MYH1 (Gambar Tambahan 4C–H), sing nuduhake yen kelimpahan MYH1 ora kanthi lengkap nggambarake transkriptom/proteom miofiber. Kesimpulan sing padha uga digayuh nalika netepake ekspresi campuran saka telung isoform MYH ing tingkat UMAP (Gambar Tambahan 4I–J). Dadi, nalika serat 2X bisa diidentifikasi ing tingkat transkrip adhedhasar kuantifikasi MYH wae, serat MYH1+ ora bisa dibedakake saka serat cepet liyane nalika nimbang kabeh transkriptom utawa proteom.
Minangka eksplorasi awal babagan heterogenitas serat alon ngluwihi MYH, kita ngevaluasi papat protein spesifik jinis serat alon sing wis ditetepake: TPM3, TNNT1, MYL3, lan ATP2A22. Subtipe serat alon nuduhake korelasi Pearson sing dhuwur, sanajan ora sampurna, karo MYH7 ing transkriptomik (Gambar Tambahan 5A) lan proteomik (Gambar Tambahan 5B). Kira-kira 25% lan 33% serat alon ora diklasifikasikake minangka serat alon murni dening kabeh subtipe gen/protein ing transkriptomik (Gambar Tambahan 5C) lan proteomik (Gambar Tambahan 5D). Mulane, klasifikasi serat alon adhedhasar pirang-pirang subtipe gen/protein ngenalake kerumitan tambahan, sanajan kanggo protein sing dikenal minangka spesifik jinis serat. Iki nuduhake yen klasifikasi serat adhedhasar isoform saka kulawarga gen/protein tunggal bisa uga ora nggambarake heterogenitas serat otot rangka kanthi cukup.
Kanggo njelajah luwih lanjut variabilitas fenotipik serat otot rangka manungsa ing skala kabeh model omics, kita nindakake reduksi dimensionalitas data sing ora bias nggunakake analisis komponen utama (PCA) (Gambar 2A). Padha karo plot UMAP, peserta utawa dina uji coba ora mengaruhi kluster serat ing tingkat PCA (Gambar Tambahan 6A-C). Ing kaloro set data, jinis serat adhedhasar MYH diterangake dening PC2, sing nuduhake kluster serat tipe 1 sing alon-kedut lan kluster kapindho sing ngemot tipe 2A sing cepet-kedut, tipe 2X, lan serat 2A/2X campuran (Gambar 2A). Ing kaloro set data, loro kluster iki disambungake dening sawetara serat tipe 1/2A campuran. Kaya sing dikarepake, analisis overrepresentasi saka driver PC utama ngonfirmasi manawa PC2 didorong dening tandha kontraktil lan metabolik (Gambar 2B lan Gambar Tambahan 6D-E, Set Data Tambahan 5-6). Sakabèhé, jinis serat adhedhasar MYH ditemokake cukup kanggo njelasake variasi terus-terusan ing sadawane PC2, kajaba serat sing diarani 2X sing disebar ing saindenging transkriptom ing kluster cepet.
A. Plot analisis komponen utama (PCA) saka set data transkriptom lan proteom sing diwernani miturut jinis serat adhedhasar MYH. B. Analisis pengayaan driver transkrip lan protein ing PC2 lan PC1. Analisis statistik ditindakake nggunakake paket clusterProfiler lan nilai-p sing diatur Benjamini-Hochberg. C, D. Plot PCA sing diwernani miturut istilah ontologi gen adhesi antar sel (GO) ing istilah transkriptom lan costamere GO ing proteom. Panah makili driver transkrip lan protein lan arahe. E, F. Plot fitur pendekatan lan proyeksi manifold seragam (UMAP) saka fitur sing relevan sacara klinis sing nuduhake gradien ekspresi sing ora gumantung saka jinis serat alon/cepet. G, H. Korelasi antarane driver PC2 lan PC1 ing transkriptom lan proteom.
Tanpa diduga, jinis miofiber adhedhasar MYH mung nerangake derajat variabilitas paling dhuwur nomer loro (PC2), sing nuduhake manawa faktor biologis liyane sing ora ana gandhengane karo jinis miofiber adhedhasar MYH (PC1) nduweni peran penting kanggo ngatur heterogenitas serat otot rangka. Analisis overrepresentasi saka pendorong utama ing PC1 nuduhake manawa variabilitas ing PC1 utamane ditemtokake dening adhesi sel-sel lan isi ribosom ing transkriptom, lan kostamere lan protein ribosom ing proteom (Gambar 2B lan Gambar Tambahan 6D-E, Set Data Tambahan 7). Ing otot rangka, kostamere nyambungake cakram-Z menyang sarkolema lan melu transmisi gaya lan sinyal. 25 Plot PCA sing dianotasi nggunakake fitur adhesi sel-sel (transkriptom, Gambar 2C) lan kostamere (proteom, Gambar 2D) nuduhake pergeseran kiwa sing kuwat ing PC1, sing nuduhake manawa fitur kasebut diperkaya ing serat tartamtu.
Pamriksaan sing luwih rinci babagan kluster miofiber ing tingkat UMAP nuduhake manawa umume fitur nuduhake gradien ekspresi adhedhasar MYH sing ora gumantung karo jinis miofiber tinimbang subkluster miofiber sing spesifik. Kontinuitas iki diamati kanggo sawetara gen sing ana gandhengane karo kondisi patologis (Gambar 2E), kayata CHCHD10 (penyakit neuromuskular), SLIT3 (atrofi otot), CTDNEP1 (penyakit otot). Kontinuitas iki uga diamati ing proteom, kalebu protein sing ana gandhengane karo kelainan neurologis (UGDH), sinyal insulin (PHIP), lan transkripsi (HIST1H2AB) (Gambar 2F). Sacara kolektif, data kasebut nuduhake kontinuitas ing heterogenitas kedutan alon/cepet sing ora gumantung karo jinis serat ing macem-macem miofiber.
Menariknya, gen driver ing PC2 nuduhake korelasi transkriptom-proteom sing apik (r = 0,663) (Gambar 2G), sing nuduhake yen jinis serat kedutan alon lan cepet, lan utamane sifat kontraktil lan metabolik serat otot rangka, diatur sacara transkripsi. Nanging, gen driver ing PC1 ora nuduhake korelasi transkriptom-proteom (r = -0,027) (Gambar 2H), sing nuduhake yen variasi sing ora ana hubungane karo jinis serat kedutan alon/cepet umume diatur sacara pasca-transkripsi. Amarga variasi ing PC1 utamane diterangake dening istilah ontologi gen ribosom, lan amarga ribosom nduweni peran penting lan khusus ing sel kanthi aktif melu lan mengaruhi terjemahan protein,31 sabanjure kita miwiti nyelidiki heterogenitas ribosom sing ora dikarepke iki.
Pisanan kita ngwarnai plot analisis komponen utama proteomik miturut kelimpahan relatif protein ing istilah GOCC "ribosom sitoplasma" (Gambar 3A). Sanajan istilah iki diperkaya ing sisih positif PC1, sing nyebabake gradien cilik, protein ribosom ndorong partisi ing loro arah PC1 (Gambar 3A). Protein ribosom sing diperkaya ing sisih negatif PC1 kalebu RPL18, RPS18, lan RPS13 (Gambar 3B), dene RPL31, RPL35, lan RPL38 (Gambar 3C) minangka pendorong utama ing sisih positif PC1. Menariknya, RPL38 lan RPS13 diekspresikan kanthi dhuwur ing otot rangka dibandhingake karo jaringan liyane (Gambar Tambahan 7A). Tandha ribosom sing khas ing PC1 iki ora diamati ing transkriptom (Gambar Tambahan 7B), sing nuduhake regulasi pasca-transkripsi.
A. Plot analisis komponen utama (PCA) diwernani miturut istilah ontologi gen ribosom sitoplasma (GO) ing proteom. Panah nuduhake arah variasi sing dimediasi protein ing plot PCA. Dawane garis cocog karo skor komponen utama kanggo protein sing diwenehake. B, C. Plot fitur PCA kanggo RPS13 lan RPL38. D. Analisis kluster hierarkis tanpa pengawasan saka protein ribosom sitoplasma. E. Model struktural ribosom 80S (PDB: 4V6X) sing nyorot protein ribosom kanthi macem-macem kelimpahan ing serat otot rangka. F. Protein ribosom kanthi stoikiometri sing beda-beda sing dilokalisasi cedhak saluran metu mRNA.
Konsep heterogenitas lan spesialisasi ribosom wis diusulake sadurunge, ing ngendi anané subpopulasi ribosom sing béda (heterogenitas ribosom) bisa langsung mengaruhi terjemahan protein ing jaringan lan sel sing béda32 liwat terjemahan selektif saka kumpulan transkrip mRNA tartamtu34 (spesialisasi ribosom). Kanggo ngenali subpopulasi protein ribosom sing diekspresikan bebarengan ing serat otot rangka, kita nindakake analisis kluster hierarkis tanpa pengawasan saka protein ribosom ing proteom (Gambar 3D, Set Data Tambahan 8). Kaya sing dikarepake, protein ribosom ora kluster miturut jinis serat adhedhasar MYH. Nanging, kita ngidentifikasi telung kluster protein ribosom sing béda; kluster pertama (ribosomal_cluster_1) dikoregulasi karo RPL38 lan mulane wis nambah ekspresi ing serat kanthi profil PC1 positif. Kluster kapindho (ribosomal_cluster_2) dikoregulasi karo RPS13 lan dhuwur ing serat kanthi profil PC1 negatif. Gugus katelu (gugus_ribosomal_3) ora nuduhake ekspresi diferensial sing terkoordinasi ing serat otot rangka lan bisa dianggep minangka protein ribosom otot rangka "inti". Gugus ribosom 1 lan 2 ngemot protein ribosom sing sadurunge wis dituduhake ngatur terjemahan alternatif (kayata, RPL10A, RPL38, RPS19, lan RPS25) lan kanthi fungsional mengaruhi perkembangan (kayata, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Konsisten karo asil PCA, perwakilan heterogen sing diamati saka protein ribosom iki ing serat uga nuduhake kontinuitas (Gambar Tambahan 7C).
Kanggo nggambarake lokasi protein ribosom heterogen ing njero ribosom, kita nggunakake model struktural ribosom 80S manungsa (Protein Data Bank: 4V6X) (Gambar 3E). Sawise ngisolasi protein ribosom sing kagolong ing kluster ribosom sing beda-beda, lokasine ora padha, sing nuduhake yen pendekatan kita gagal nyedhiyakake pengayaan kanggo wilayah/fraksi ribosom tartamtu. Nanging, sing menarik, proporsi protein subunit gedhe ing kluster 2 luwih murah tinimbang ing kluster 1 lan 3 (Gambar Tambahan 7D). Kita mirsani yen protein kanthi stoikiometri sing diganti ing serat otot rangka utamane dilokalisasi ing permukaan ribosom (Gambar 3E), konsisten karo kemampuane kanggo sesambungan karo unsur situs mlebu ribosom internal (IRES) ing populasi mRNA sing beda-beda, saengga koordinasi terjemahan selektif. 40, 41 Salajengipun, akeh protein kanthi stoikiometri sing diganti ing serat otot rangka dumunung cedhak wilayah fungsional kayata trowongan metu mRNA (Gambar 3F), sing kanthi selektif ngatur elongasi translasi lan penahanan peptida tartamtu. 42 Ringkesane, data kita nuduhake yen stoikiometri protein ribosom otot rangka nuduhake heterogenitas, sing nyebabake bedane antarane serat otot rangka.
Sabanjure, kita miwiti ngenali tandha-tandha serat kedutan cepet lan alon lan njelajah mekanisme regulasi transkripsi. Mbandhingake kluster serat kedutan cepet lan alon sing ditetepake dening UMAP ing rong set data (Gambar 1G-H lan 4A-B), analisis transkriptomik lan proteomik ngidentifikasi 1366 lan 804 fitur sing akeh banget kanthi beda (Gambar 4A-B, Set Data Tambahan 9-12). Kita mirsani bedane sing diarepake ing tandha-tandha sing ana gandhengane karo sarkomer (kayata, tropomiosin lan troponin), kopling eksitasi-kontraksi (isoform SERCA), lan metabolisme energi (kayata, ALDOA lan CKB). Kajaba iku, transkrip lan protein sing ngatur ubiquitinasi protein diekspresikan kanthi beda ing serat kedutan cepet lan alon (kayata, USP54, SH3RF2, USP28, lan USP48) (Gambar 4A-B). Kajaba iku, gen protein mikroba RP11-451G4.2 (DWORF), sing sadurunge wis dituduhake diekspresikan kanthi beda ing antarane jinis serat otot domba43 lan nambah aktivitas SERCA ing otot jantung44, sacara signifikan diregulasi ing serat otot rangka alon (Gambar 4A). Kajaba iku, ing tingkat serat individu, bedane sing signifikan diamati ing tandha-tandha sing dikenal kayata isoform laktat dehidrogenase sing ana gandhengane karo metabolisme (LDHA lan LDHB, Gambar 4C lan Gambar Tambahan 8A)45,46 uga tandha-tandha khusus jinis serat sing sadurunge ora dingerteni (kayata IRX3, USP54, USP28, lan DPYSL3) (Gambar 4C). Ana tumpang tindih sing signifikan saka fitur sing diekspresikan kanthi beda antarane set data transkriptomik lan proteomik (Gambar Tambahan 8B), uga korelasi owah-owahan lipatan sing didorong utamane dening ekspresi diferensial fitur sarkomer sing luwih jelas (Gambar Tambahan 8C). Khususé, sawetara tandha tangan (kayata USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) nuduhake regulasi pasca-transkripsi sing kuwat mung ing tingkat proteomik lan nduweni profil ekspresi spesifik jinis serat kedutan alon/cepet (Gambar Tambahan 8C).
Plot gunung geni A lan B sing mbandhingake kluster alon lan cepet sing diidentifikasi dening plot approximation and projection manifold seragam (UMAP) ing Gambar 1G-H. Titik-titik warna makili transkrip utawa protein sing beda banget ing FDR <0,05, lan titik-titik sing luwih peteng makili transkrip utawa protein sing beda banget ing owah-owahan log > 1. Analisis statistik rong arah ditindakake nggunakake uji DESeq2 Wald kanthi nilai p sing disesuaikan Benjamini-Hochberg (transkriptomik) utawa metode model linier Limma kanthi analisis Bayesian empiris diikuti dening penyesuaian Benjamini-Hochberg kanggo pirang-pirang perbandingan (proteomik). C Plot tandha gen utawa protein sing diekspresikan kanthi beda sing dipilih antarane serat alon lan cepet. D Analisis pengayaan transkrip lan protein sing diekspresikan kanthi beda sing signifikan. Nilai sing tumpang tindih diperkaya ing loro set data, nilai transkriptom mung diperkaya ing transkriptom, lan nilai proteom mung diperkaya ing proteom. Analisis statistik ditindakake nggunakake paket clusterProfiler kanthi nilai-p sing disesuaikan Benjamini-Hochberg. E. Faktor transkripsi spesifik tipe serat sing diidentifikasi dening SCENIC adhedhasar skor spesifisitas regulator sing asale saka SCENIC lan ekspresi mRNA diferensial antarane tipe serat. F. Profil faktor transkripsi sing dipilih sing diekspresikan kanthi beda antarane serat alon lan cepet.
Banjur kita nindakake analisis overrepresentasi saka gen lan protein sing diwakili kanthi beda (Gambar 4D, Set Data Tambahan 13). Pengayaan jalur kanggo fitur sing beda antarane rong set data nuduhake beda sing diarepake, kayata proses metabolisme β-oksidasi asam lemak lan keton (serat alon), kontraksi miofilamen/otot (serat cepet lan alon), lan proses katabolik karbohidrat (serat cepet). Aktivitas protein fosfatase serin/treonin uga tambah akeh ing serat cepet, didorong dening fitur kayata subunit fosfatase pangaturan lan katalitik (PPP3CB, PPP1R3D, lan PPP1R3A), sing dikenal ngatur metabolisme glikogen (47) (Gambar Tambahan 8D–E). Jalur liyane sing sugih ing serat cepet kalebu badan pangolahan (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) ing proteom (Gambar Tambahan 8F), sing duweni potensi melu regulasi pasca-transkripsi (48), lan aktivitas faktor transkripsi (SREBF1, RXRG, RORA) ing transkriptom (Gambar Tambahan 8G). Serat alon sugih ing aktivitas oksidoreduktase (BDH1, DCXR, TXN2) (Gambar Tambahan 8H), pengikatan amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Gambar Tambahan 8I), matriks ekstraseluler (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Gambar Tambahan 8J), lan aktivitas reseptor-ligan (FNDC5, SPX, NENF) (Gambar Tambahan 8K).
Kanggo entuk wawasan luwih lanjut babagan regulasi transkripsi sing ndasari karakteristik jinis serat otot alon/cepet, kita nindakake analisis pengayaan faktor transkripsi nggunakake SCENIC49 (Set Data Tambahan 14). Akeh faktor transkripsi sing diperkaya sacara signifikan antarane serat otot cepet lan alon (Gambar 4E). Iki kalebu faktor transkripsi kayata MAFA, sing sadurunge wis ana gandhengane karo perkembangan serat otot cepet,50 uga sawetara faktor transkripsi sing sadurunge ora ana gandhengane karo program gen spesifik jinis serat otot. Antarane, PITX1, EGR1, lan MYF6 minangka faktor transkripsi sing paling diperkaya ing serat otot cepet (Gambar 4E). Kosok baline, ZSCAN30 lan EPAS1 (uga dikenal minangka HIF2A) minangka faktor transkripsi sing paling diperkaya ing serat otot alon (Gambar 4E). Konsisten karo iki, MAFA diekspresikan ing tingkat sing luwih dhuwur ing wilayah UMAP sing cocog karo serat otot cepet, dene EPAS1 duwe pola ekspresi sing ngelawan (Gambar 4F).
Saliyané gen pengkode protein sing dikenal, ana akèh biotipe RNA non-koding sing bisa uga melu regulasi perkembangan lan penyakit manungsa. 51, 52 Ing set data transkriptom, sawetara RNA non-koding nuduhaké spesifisitas jinis serat (Gambar 5A lan Set Data Tambahan 15), kalebu LINC01405, sing spesifik banget kanggo serat alon lan dilapurake mudhun ing otot saka pasien karo miopati mitokondria. 53 Kosok baline, RP11-255P5.3, sing cocog karo gen lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, nuduhaké spesifisitas jinis serat cepet. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) lan RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) nduweni spesifisitas otot rangka (Gambar Tambahan 9A–B) lan ora duwe gen kontraktil sing dikenal ing lingkungan genomik 1 Mb, sing nuduhake yen dheweke nduweni peran khusus kanggo ngatur jinis serat tinimbang ngatur gen kontraktil ing sacedhake. Profil ekspresi spesifik jinis serat alon/cepet saka LINC01405 lan RP11-255P5.3, masing-masing, dikonfirmasi nggunakake RNAscope (Gambar 5B–C).
A. Transkrip RNA non-coding diatur sacara signifikan ing serat otot kedutan alon lan cepet. B. Gambar RNAscope representatif sing nuduhake spesifisitas jinis serat kedutan alon lan cepet saka LINC01405 lan RP11-255P5.3, masing-masing. Bar skala = 50 μm. C. Kuantifikasi ekspresi RNA non-coding spesifik jinis miofiber sing ditemtokake dening RNAscope (n = 3 biopsi saka individu independen, mbandhingake serat otot cepet lan alon ing saben individu). Analisis statistik ditindakake nggunakake uji-t Student rong sisi. Plot kothak nuduhake median lan kuartil pertama lan katelu, kanthi kumis nuduhake nilai minimum lan maksimum. D. Alur kerja identifikasi protein mikroba de novo (digawe karo BioRender.com). E. Protein mikroba LINC01405_ORF408:17441:17358 khusus diekspresikan ing serat otot rangka alon (n = 5 biopsi saka peserta independen, mbandhingake serat otot cepet lan alon ing saben peserta). Analisis statistik ditindakake nggunakake metode model linier Limm sing digabungake karo pendekatan Bayesian empiris, banjur metode Benjamini-Hochberg kanggo perbandingan pirang-pirang kanthi penyesuaian nilai-p. Plot kothak nuduhake median, kuartil pertama lan katelu, kanthi kumis nuduhake nilai maksimum/minimal.
Bubar iki, panliten nuduhake yen akeh transkrip non-coding putative ngode protein mikroba sing ditranskripsi, sawetara ngatur fungsi otot. 44, 55 Kanggo ngenali protein mikroba kanthi spesifisitas jinis serat potensial, kita nggoleki dataset proteom 1000 serat nggunakake file FASTA khusus sing ngemot urutan transkrip non-coding (n = 305) sing ditemokake ing dataset transkriptom 1000 serat (Gambar 5D). Kita ngidentifikasi 197 protein mikroba saka 22 transkrip sing beda, 71 sing diatur kanthi beda antarane serat otot rangka alon lan cepet (Gambar Tambahan 9C lan Set Data Tambahan 16). Kanggo LINC01405, telung produk protein mikroba diidentifikasi, salah sijine nuduhake spesifisitas serat alon sing padha karo transkrip (Gambar 5E lan Gambar Tambahan 9D). Dadi, kita ngidentifikasi LINC01405 minangka gen sing ngode protein mikroba khusus kanggo serat otot rangka alon.
Kita ngembangake alur kerja sing komprehensif kanggo karakterisasi proteomik skala gedhe saka serat otot individu lan ngidentifikasi regulator heterogenitas serat ing kahanan sehat. Kita ngetrapake alur kerja iki kanggo mangerteni kepiye miopati nemalin mengaruhi heterogenitas serat otot rangka. Miopati nemalin minangka penyakit otot turun temurun sing nyebabake kelemahan otot lan, ing bocah-bocah sing kena pengaruh, muncul kanthi macem-macem komplikasi kalebu gangguan pernapasan, skoliosis, lan mobilitas anggota awak sing winates. 19,20 Biasane, ing miopati nemalin, varian patogen ing gen kayata aktin alpha 1 (ACTA1) nyebabake dominasi komposisi miofiber serat kedutan alon, sanajan efek iki heterogen. Salah sawijining pangecualian sing penting yaiku troponin T1 miopati nemalin (TNNT1), sing nduweni dominasi serat cepet. Dadi, pangerten sing luwih apik babagan heterogenitas sing ndasari disregulasi serat otot rangka sing diamati ing miopati nemalin bisa mbantu mbukak hubungan kompleks antarane penyakit kasebut lan jinis miofiber.
Dibandhingake karo kontrol sehat (n=3 saben klompok), serat mio sing diisolasi saka pasien miopati nemalin kanthi mutasi ing gen ACTA1 lan TNNT1 nuduhake atrofi utawa distrofi serat mio sing ditandhani (Gambar 6A, Tabel Tambahan 3). Iki nuduhake tantangan teknis sing signifikan kanggo analisis proteomik amarga jumlah materi sing kasedhiya winates. Senadyan mangkono, kita bisa ndeteksi 2485 protein ing 272 serat mio rangka. Sawise nyaring paling ora 1000 protein sing diukur saben serat, 250 serat ditindakake analisis bioinformatika sabanjure. Sawise nyaring, rata-rata 1573 ± 359 protein saben serat diukur (Gambar Tambahan 10A, Set Data Tambahan 17–18). Khususé, sanajan ana pangurangan ukuran serat sing signifikan, ambane proteom sampel pasien miopati nemalin mung rada suda. Kajaba iku, pangolahan data iki nggunakake file FASTA dhewe (kalebu transkrip non-coding) ngidini kita ngenali limang protein mikroba ing miofiber rangka saka pasien miopati nemalin (Set Data Tambahan 19). Rentang dinamis proteom luwih jembar, lan total protein ing klompok kontrol berkorelasi apik karo asil analisis proteom 1000-serat sadurunge (Gambar Tambahan 10B–C).
A. Gambar mikroskopis sing nuduhake atrofi utawa distrofi serat lan dominasi jinis serat sing beda-beda adhedhasar MYH ing miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1 (NM). Skala bar = 100 μm. Kanggo njamin reproduksibilitas pewarnaan ing pasien ACTA1 lan TNNT1, telung biopsi pasien diwarnai kaping pindho nganti kaping telu (papat bagean saben kasus) sadurunge milih gambar sing representatif. B. Proporsi jinis serat ing peserta adhedhasar MYH. C. Plot analisis komponen utama (PCA) serat otot rangka ing pasien miopati nemalin lan kontrol. D. Serat otot rangka saka pasien miopati nemalin lan kontrol sing diproyeksikan menyang plot PCA sing ditemtokake saka 1000 serat sing dianalisis ing Gambar 2. Contone, plot gunung geni sing mbandhingake bedane antarane peserta miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1 lan kontrol, lan antarane peserta miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1. Bunderan warna-warni nuduhake protein sing beda banget ing π < 0,05, lan titik-titik peteng nuduhake protein sing beda banget ing FDR < 0,05. Analisis statistik ditindakake nggunakake metode model linier Limma lan metode Bayesian empiris, banjur penyesuaian nilai-p kanggo pirang-pirang perbandingan nggunakake metode Benjamini-Hochberg. H. Analisis pengayaan protein sing diekspresikan kanthi beda banget ing kabeh proteom lan ing serat tipe 1 lan 2A. Analisis statistik ditindakake nggunakake paket clusterProfiler lan nilai-p sing disesuaikan karo Benjamini-Hochberg. I, J. Plot analisis komponen utama (PCA) sing diwarnai dening matriks ekstraseluler lan istilah ontologi gen mitokondria (GO).
Amarga miopati nemalin bisa mengaruhi proporsi jinis miofiber sing ngekspresikan MYH ing otot rangka,19,20, kita pisanan nliti jinis miofiber sing ngekspresikan MYH ing pasien miopati nemalin lan kontrol. Kita nemtokake jinis miofiber nggunakake metode sing ora bias sing wis diterangake sadurunge kanggo uji 1000 miofiber (Gambar Tambahan 10D–E) lan maneh gagal ngenali miofiber 2X murni (Gambar 6B). Kita mirsani efek heterogen saka miopati nemalin ing jinis miofiber, amarga rong pasien kanthi mutasi ACTA1 duwe proporsi miofiber tipe 1 sing tambah, dene rong pasien kanthi miopati nemalin TNNT1 duwe proporsi miofiber tipe 1 sing mudhun (Gambar 6B). Pancen, ekspresi MYH2 lan isoform troponin cepet (TNNC2, TNNI2, lan TNNT3) mudhun ing miopati ACTA1-nemaline, dene ekspresi MYH7 mudhun ing miopati TNNT1-nemaline (Gambar Tambahan 11A). Iki konsisten karo laporan sadurunge babagan switching jinis miofiber heterogen ing miopati nemaline.19,20 Kita ngonfirmasi asil kasebut kanthi imunohistokimia lan nemokake manawa pasien karo miopati ACTA1-nemaline duwe dominasi miofiber tipe 1, dene pasien karo miopati TNNT1-nemaline duwe pola sing ngelawan (Gambar 6A).
Ing tingkat proteom serat tunggal, serat otot rangka saka pasien miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1 nglumpuk karo mayoritas serat kontrol, kanthi serat miopati nemalin TNNT1 umume sing paling kena pengaruh (Gambar 6C). Iki katon banget nalika ngrancang plot analisis komponen utama (PCA) saka serat pseudo-inflated kanggo saben pasien, kanthi pasien miopati nemalin TNNT1 2 lan 3 katon paling adoh saka sampel kontrol (Gambar Tambahan 11B, Set Data Tambahan 20). Kanggo luwih ngerti kepiye serat saka pasien miopati dibandhingake karo serat sing sehat, kita nggunakake informasi rinci sing dipikolehi saka analisis proteomik 1.000 serat saka peserta diwasa sing sehat. Kita ngproyeksikan serat saka set data miopati (pasien lan kontrol miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1) menyang plot PCA sing dipikolehi saka analisis proteomik 1000 serat (Gambar 6D). Distribusi jinis serat MYH ing sadawane PC2 ing serat kontrol padha karo distribusi serat sing dipikolehi saka analisis proteomik 1000 serat. Nanging, umume serat ing pasien miopati nemalin pindhah mudhun PC2, tumpang tindih karo serat kedutan cepet sing sehat, preduli saka jinis serat MYH asli. Dadi, sanajan pasien karo miopati nemalin ACTA1 nuduhake owah-owahan menyang serat tipe 1 nalika diukur nggunakake metode adhedhasar MYH, miopati nemalin ACTA1 lan miopati nemalin TNNT1 mindhah proteom serat otot rangka menyang serat kedutan cepet.
Banjur kita mbandhingake saben klompok pasien kanthi langsung karo kontrol sing sehat lan ngidentifikasi 256 lan 552 protein sing diekspresikan kanthi beda ing miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1, masing-masing (Gambar 6E–G lan Gambar Tambahan 11C, Set Data Tambahan 21). Analisis pengayaan gen nuduhake penurunan protein mitokondria sing terkoordinasi (Gambar 6H–I, Set Data Tambahan 22). Sing nggumunake, sanajan ana dominasi jinis serat sing beda ing miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1, penurunan iki pancen ora gumantung karo jinis serat adhedhasar MYH (Gambar 6H lan Gambar Tambahan 11D–I, Set Data Tambahan 23). Telung protein mikroba uga diatur ing miopati nemalin ACTA1 utawa TNNT1. Rong mikroprotein iki, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (uga dikenal minangka LINC00598 utawa Lnc-FOXO1) lan ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), nuduhake kelimpahan sing beda mung ing miofiber tipe 1. ENSG00000215483_TR14_ORF67 sadurunge wis dilapurake nduweni peran ing regulasi siklus sel. 56 Ing sisih liya, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (sing cocog karo LINC01798) tambah ing miofiber tipe 1 lan tipe 2A ing miopati ACTA1-nemaline dibandhingake karo kontrol sehat (Gambar Tambahan 12A, Set Data Tambahan 24). Kosok baline, protein ribosom umume ora kena pengaruh miopati nemalin, sanajan RPS17 mudhun regulasi ing miopati nemalin ACTA1 (Gambar 6E).
Analisis pengayaan uga nuduhake peningkatan regulasi proses sistem kekebalan ing miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1, dene adhesi sel uga tambah ing miopati nemalin TNNT1 (Gambar 6H). Pengayaan faktor ekstraseluler iki dicerminkan dening protein matriks ekstraseluler sing nggeser PCA ing PC1 lan PC2 kanthi arah negatif (yaiku, menyang serat sing paling kena pengaruh) (Gambar 6J). Kaloro klompok pasien nuduhake peningkatan ekspresi protein ekstraseluler sing melu respon imun lan mekanisme perbaikan sarkolema, kayata annexin (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 lan protein interaksi S100A1159 (Gambar Tambahan 12B–C). Proses iki sadurunge wis dilaporake saya tambah ing distrofi otot60 nanging, miturut kawruh kita, sadurunge durung ana gandhengane karo miopati nemalin. Fungsi normal mesin molekuler iki dibutuhake kanggo perbaikan sarkolema sawise ciloko lan kanggo fusi miosit sing mentas kawangun karo miofiber58,61. Dadi, tambahing aktivitas proses iki ing kaloro klompok pasien nuduhake respon reparatif kanggo ciloko sing disebabake dening ketidakstabilan miofiber.
Efek saka saben miopati nemalin berkorelasi apik (r = 0,736) lan nuduhake tumpang tindih sing cukup (Gambar Tambahan 11A–B), sing nuduhake yen miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1 duwe efek sing padha ing proteome. Nanging, sawetara protein mung diatur ing miopati nemalin ACTA1 utawa TNNT1 (Gambar Tambahan 11A lan C). Protein profibrotik MFAP4 minangka salah sawijining protein sing paling akeh diatur ing miopati nemalin TNNT1 nanging tetep ora owah ing miopati nemalin ACTA1. SKIC8, komponen kompleks PAF1C sing tanggung jawab kanggo ngatur transkripsi gen HOX, mudhun diatur ing miopati nemalin TNNT1 nanging ora kena pengaruh ing miopati nemalin ACTA1 (Gambar Tambahan 11A). Perbandingan langsung saka miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1 nuduhake pengurangan protein mitokondria sing luwih gedhe lan peningkatan protein sistem kekebalan ing miopati nemalin TNNT1 (Gambar 6G–H lan Gambar Tambahan 11C lan 11H–I). Data iki konsisten karo atrofi/distrofi sing luwih gedhe sing diamati ing miopati nemalin TNNT1 dibandhingake karo miopati nemalin TNNT1 (Gambar 6A), sing nuduhake yen miopati nemalin TNNT1 minangka bentuk penyakit sing luwih parah.
Kanggo netepake apa efek miopati nemalin sing diamati isih ana ing kabeh tingkat otot, kita nindakake analisis proteomik massal saka biopsi otot saka kohort sing padha karo pasien miopati nemalin TNNT1 lan mbandhingake karo kontrol (n = 3 saben klompok) (Gambar Tambahan 13A, Set Data Tambahan 25). Kaya sing dikarepake, kontrol raket banget karo analisis komponen utama, dene pasien miopati nemalin TNNT1 nuduhake variabilitas antar sampel sing luwih dhuwur sing padha karo sing katon ing analisis serat tunggal (Gambar Tambahan 13B). Analisis massal ngasilake protein sing diekspresikan kanthi beda (Gambar Tambahan 13C, Set Data Tambahan 26) lan proses biologis (Gambar Tambahan 13D, Set Data Tambahan 27) sing disorot kanthi mbandhingake serat individu, nanging kelangan kemampuan kanggo mbedakake antarane jinis serat sing beda lan gagal ngetung efek penyakit heterogen ing antarane serat.
Yen digabungake, data iki nuduhake yen proteomik myofiber tunggal bisa njlentrehake fitur biologis klinis sing ora bisa dideteksi kanthi cara sing ditargetake kayata immunoblotting. Kajaba iku, data iki nyoroti watesan nggunakake jinis serat aktin (MYH) wae kanggo njlentrehake adaptasi fenotipik. Pancen, sanajan pangowahan jinis serat beda antarane miopati nemalin aktin lan troponin, loro miopati nemalin misahake jinis serat MYH saka metabolisme serat otot rangka menyang proteom otot sing luwih cepet lan kurang oksidatif.
Heterogenitas seluler iku penting banget kanggo jaringan supaya bisa nyukupi kabutuhan sing maneka warna. Ing otot rangka, iki asring digambarake minangka jinis serat sing ditondoi dening derajat produksi gaya lan gampang kesel sing beda-beda. Nanging, jelas yen iki mung nerangake sebagian cilik saka variabilitas serat otot rangka, sing luwih variabel, kompleks, lan multifaset tinimbang sing dipikirake sadurunge. Kemajuan teknologi saiki wis menehi cahya babagan faktor-faktor sing ngatur serat otot rangka. Pancen, data kita nuduhake yen serat tipe 2X bisa uga dudu subtipe serat otot rangka sing beda. Kajaba iku, kita ngidentifikasi protein metabolik, protein ribosom, lan protein sing ana gandhengane karo sel minangka penentu utama heterogenitas serat otot rangka. Kanthi ngetrapake alur kerja proteomik kanggo sampel pasien kanthi miopati nematoda, kita luwih lanjut nduduhake yen pengetikan serat adhedhasar MYH ora nggambarake heterogenitas otot rangka kanthi lengkap, utamane nalika sistem kasebut kaganggu. Pancen, preduli saka jinis serat adhedhasar MYH, miopati nematoda nyebabake pergeseran menyang serat sing luwih cepet lan kurang oksidatif.
Serat otot rangka wis diklasifikasikake wiwit abad kaping 19. Analisis omics anyar wis ngidini kita miwiti mangerteni profil ekspresi saka macem-macem jinis serat MYH lan respon kanggo macem-macem rangsangan. Kaya sing diterangake ing kene, pendekatan omics uga duwe kauntungan saka sensitivitas sing luwih gedhe kanggo ngukur penanda jinis serat tinimbang metode adhedhasar antibodi tradisional, tanpa gumantung ing kuantifikasi siji (utawa sawetara) penanda kanggo nemtokake jinis serat otot rangka. Kita nggunakake alur kerja transkriptomik lan proteomik komplementer lan nggabungake asil kanggo mriksa regulasi transkripsi lan pasca-transkripsi heterogenitas serat ing serat otot rangka manungsa. Alur kerja iki nyebabake kegagalan kanggo ngenali serat tipe 2X murni ing tingkat protein ing vastus lateralis saka kohort wong enom sing sehat. Iki konsisten karo panliten serat tunggal sadurunge sing nemokake <1% serat 2X murni ing vastus lateralis sing sehat, sanajan iki kudu dikonfirmasi ing otot liyane ing mangsa ngarep. Beda antarane deteksi serat 2X sing meh murni ing tingkat mRNA lan mung serat 2A/2X campuran ing tingkat protein pancen mbingungake. Ekspresi mRNA isoform MYH dudu sirkadian,67 sing nuduhake yen kita ora mungkin "kelewat" sinyal wiwitan MYH2 ing serat 2X sing katon murni ing tingkat RNA. Salah sawijining panjelasan sing bisa ditindakake, sanajan mung hipotesis, bisa uga beda ing stabilitas protein lan/utawa mRNA antarane isoform MYH. Pancen, ora ana serat cepet sing 100% murni kanggo isoform MYH apa wae, lan ora jelas apa tingkat ekspresi mRNA MYH1 ing kisaran 70-90% bakal nyebabake kelimpahan MYH1 lan MYH2 sing padha ing tingkat protein. Nanging, nalika nimbang kabeh transkriptom utawa proteom, analisis kluster bisa kanthi yakin ngenali mung rong kluster sing beda sing makili serat otot rangka alon lan cepet, preduli saka komposisi MYH sing tepat. Iki konsisten karo analisis nggunakake pendekatan transkriptomik inti tunggal, sing biasane mung ngenali rong kluster mionuklear sing beda. 68, 69, 70 Salajengipun, sanajan panaliten proteomik saderengipun sampun ngidentifikasi serat tipe 2X, serat-serat punika boten nglumpuk kanthi kapisah saking serat cepet sanès lan namung nedahaken sapérangan alit protein ingkang kathah sanget dipunbandingaken kaliyan jinis serat sanès adhedhasar MYH. 14 Asil punika nedahaken bilih kita kedah wangsul dhateng pandangan awal abad kaping 20 babagan klasifikasi serat otot, ingkang mbagi serat otot rangka manungsa boten dados tigang kelas ingkang béda adhedhasar MYH, nanging dados kalih kluster adhedhasar sipat metabolisme lan kontraktilipun. 63
Sing luwih penting, heterogenitas miofiber kudu ditimbang ing pirang-pirang dimensi. Panliten "omics" sadurunge wis nuduhake arah iki, sing nuduhake yen serat otot rangka ora mbentuk kluster sing diskrit nanging disusun ing sadawane kontinum. 11, 13, 14, 64, 71 Ing kene, kita nuduhake yen, saliyane bedane sifat kontraktil lan metabolisme otot rangka, miofiber bisa dibedakake kanthi fitur sing ana gandhengane karo interaksi sel-sel lan mekanisme terjemahan. Pancen, kita nemokake heterogenitas ribosom ing serat otot rangka sing nyumbang kanggo heterogenitas sing ora gumantung saka jinis serat alon lan cepet. Penyebab sing ndasari heterogenitas miofiber sing substansial iki, ora gumantung saka jinis serat alon lan cepet, isih durung jelas, nanging bisa uga nuduhake organisasi spasial khusus ing fasikel otot sing nanggapi kanthi optimal marang gaya lan beban tartamtu,72 komunikasi seluler utawa organ khusus karo jinis sel liyane ing lingkungan mikro otot73,74,75 utawa bedane aktivitas ribosom ing miofiber individu. Pancen, heteroplasmi ribosom, liwat substitusi paralogous RPL3 lan RPL3L utawa ing tingkat 2′O-metilasi rRNA, wis dituduhake ana gandhengane karo hipertrofi otot rangka76,77. Aplikasi multi-omik lan spasial sing digabungake karo karakterisasi fungsional miofiber individu bakal luwih maju pangerten kita babagan biologi otot ing tingkat multi-omik78.
Kanthi nganalisis proteom saka miofiber tunggal saka pasien sing nandhang miopati nemalin, kita uga nduduhake kegunaan, efektifitas, lan penerapan proteomik miofiber tunggal kanggo njlentrehake patofisiologi klinis otot rangka. Kajaba iku, kanthi mbandhingake alur kerja kita karo analisis proteomik global, kita bisa nduduhake manawa proteomik miofiber tunggal ngasilake ambane informasi sing padha karo proteomik jaringan global lan ngluwihi ambane iki kanthi ngetung heterogenitas interfiber lan jinis miofiber. Saliyane beda sing diarepake (sanajan variabel) ing rasio jinis serat sing diamati ing miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1 dibandhingake karo kontrol sehat,19 kita uga mirsani remodeling oksidatif lan ekstraseluler independen saka switching jinis serat sing dimediasi MYH. Fibrosis sadurunge wis dilapurake ing miopati nemalin TNNT1.19 Nanging, analisis kita dibangun ing temuan iki kanthi uga mbukak tingkat protein sing ana gandhengane karo stres sing disekresi ekstraseluler, kayata annexin, sing melu mekanisme ndandani sarkolema, ing miofiber saka pasien karo miopati nemalin ACTA1 lan TNNT1.57,58,59 Kesimpulane, tingkat annexin sing tambah ing miofiber saka pasien karo miopati nemalin bisa uga minangka respon seluler kanggo ndandani miofiber atrofi sing parah.
Senajan panliten iki minangka analisis otot-otot utuh serat tunggal paling gedhe saka manungsa nganti saiki, panliten iki ora tanpa watesan. Kita ngisolasi serat otot rangka saka sampel peserta sing relatif cilik lan homogen lan siji otot (vastus lateralis). Mulane, ora mungkin kanggo ngilangi anane populasi serat tartamtu ing antarane jinis otot lan ing ekstrem fisiologi otot. Contone, kita ora bisa ngilangi kemungkinan subset serat ultrafast (contone, serat 2X murni) sing muncul ing pelari cepet sing terlatih lan/utawa atlit kekuatan79 utawa sajrone periode ora aktif otot66,80. Salajengipun, ukuran sampel peserta sing winates nyegah kita nyelidiki beda jinis kelamin ing heterogenitas serat, amarga rasio jinis serat dikenal beda antarane pria lan wanita. Salajengipun, kita ora bisa nindakake analisis transkriptomik lan proteomik ing serat otot sing padha utawa sampel saka peserta sing padha. Nalika kita lan liya-liyane terus ngoptimalake analisis sel tunggal lan miofiber tunggal nggunakake analisis omics kanggo entuk input sampel sing ultra-rendah (kaya sing dituduhake ing analisis serat saka pasien miopati mitokondria), kesempatan kanggo nggabungake pendekatan multi-omics (lan fungsional) ing serat otot tunggal dadi jelas.
Sakabèhé, data kita ngidhèntifikasi lan njelasaké pendorong transkripsi lan pasca-transkripsi saka heterogenitas otot rangka. Sacara khusus, kita nampilake data sing nantang dogma sing wis suwé ana ing fisiologi otot rangka sing ana gandhèngané karo definisi jinis serat adhedhasar MYH klasik. Kita ngarep-arep bisa nganyari debat iki lan pungkasane mikir manèh babagan pangerten kita babagan klasifikasi lan heterogenitas serat otot rangka.
Patbelas peserta Kaukasia (12 pria lan 2 wanita) kanthi sukarela setuju melu ing panliten iki. Panliten iki disetujoni dening Komite Etik Rumah Sakit Universitas Ghent (BC-10237), tundhuk karo Deklarasi Helsinki 2013, lan kadhaptar ing ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Karakteristik umum peserta dituduhake ing Tabel Tambahan 1. Sawise entuk idin lisan lan tulisan, peserta nglakoni pemeriksaan medis sadurunge kalebu ing panliten pungkasan. Peserta isih enom (22-42 taun), sehat (ora ana kondisi medis, ora ana riwayat ngrokok), lan cukup aktif sacara fisik. Serapan oksigen maksimal ditemtokake nggunakake ergometer langkah kanggo netepake kebugaran fisik kaya sing diterangake sadurunge. 81
Sampel biopsi otot dikumpulake nalika istirahat lan nalika pasa kaping telu, kanthi jarak 14 dina. Amarga sampel iki dikumpulake minangka bagean saka panliten sing luwih gedhe, peserta ngonsumsi plasebo (laktosa), antagonis reseptor H1 (540 mg fexofenadine), utawa antagonis reseptor H2 (40 mg famotidine) 40 menit sadurunge biopsi. Sadurunge, kita wis nduduhake manawa antagonis reseptor histamin iki ora mengaruhi kebugaran otot rangka nalika istirahat81, lan ora ana kluster sing ana gandhengane karo kahanan sing diamati ing plot kontrol kualitas kita (Gambar Tambahan 3 lan 6). Diet standar (41,4 kkal/kg bobot awak, 5,1 g/kg karbohidrat bobot awak, 1,4 g/kg protein bobot awak, lan 1,6 g/kg lemak bobot awak) dijaga sajrone 48 jam sadurunge saben dina eksperimen, lan sarapan standar (1,5 g/kg karbohidrat bobot awak) dikonsumsi ing esuk dina eksperimen. Ing anestesi lokal (0,5 ml lidokain 1% tanpa epinefrin), biopsi otot dijupuk saka otot vastus lateralis nggunakake aspirasi Bergström perkutan.82 Sampel otot langsung dilebokake ing RNA lan disimpen ing suhu 4°C nganti diseksi serat manual (nganti 3 dina).
Bundel miofiber sing nembe diisolasi ditransfer menyang medium RNAlater seger ing piring kultur. Miofiber individu banjur dibedah kanthi manual nggunakake stereomikroskop lan pinset alus. Rong puluh lima serat dibedah saka saben biopsi, kanthi menehi perhatian khusus kanggo milih serat saka macem-macem area biopsi. Sawise dibedah, saben serat direndhem alon-alon ing 3 μl buffer lisis (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) sing ngemot enzim proteinase K lan DNase kanggo mbusak protein lan DNA sing ora dikarepake. Lisis sel lan penghapusan protein/DNA banjur diwiwiti kanthi vortexing singkat, muter cairan ing mikrosentrifugasi, lan inkubasi ing suhu kamar (10 menit). Lisat banjur diinkubasi ing siklus termal (T100, Bio-Rad) ing suhu 37°C suwene 5 menit, 75°C suwene 5 menit, banjur langsung disimpen ing suhu -80°C nganti diproses luwih lanjut.
Pustaka RNA poliadenylated sing kompatibel karo Illumina disiapake saka 2 µl lisat miofiber nggunakake QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Cara rinci bisa ditemokake ing manual pabrikan. Proses kasebut diwiwiti kanthi sintesis cDNA untaian pertama kanthi transkripsi terbalik, sajrone pengenal molekuler unik (UMI) lan barcode i1 spesifik sampel dikenalake kanggo njamin pangumpulan sampel lan nyuda variabilitas teknis sajrone proses hilir. cDNA saka 96 miofiber banjur dikumpulake lan dimurnèkaké nganggo manik-manik magnetik, sawise RNA dicopot lan sintesis untaian kapindho ditindakake nggunakake primer acak. Pustaka kasebut dimurnèkaké nganggo manik-manik magnetik, tag i5/i7 spesifik kolam ditambahake, lan PCR diamplifikasi. Langkah pemurnian pungkasan ngasilake perpustakaan sing kompatibel karo Illumina. Kualitas saben kolam perpustakaan ditaksir nggunakake Kit Analisis DNA Fragmen Cilik Sensitivitas Tinggi (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Adhedhasar kuantifikasi Qubit, kumpulan luwih lanjut dikumpulake ing konsentrasi equimolar (2 nM). Kumpulan sing diasilake banjur diurutake ing instrumen NovaSeq 6000 ing mode standar nggunakake NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotida) kanthi pemuatan 2 nM (4% PhiX).
Pipa kita adhedhasar pipa analisis data QuantSeq Pool Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data pisanan didemultiplex nganggo bcl2fastq2 (v2.20.0) adhedhasar indeks i7/i5. Read 2 banjur didemultiplex nganggo idemux (v0.1.6) adhedhasar barcode sampel i1 lan urutan UMI diekstrak nganggo umi_tools (v1.0.1). Reads banjur dipotong nganggo cutadapt (v3.4) ing pirang-pirang babak kanggo mbusak reads cendhak (<20 dawane) utawa reads sing mung kasusun saka urutan adaptor. Reads banjur diselarasake karo genom manungsa nggunakake STAR (v2.6.0c) lan file BAM diindeks nganggo SAMtools (v1.11). Reads duplikat dibusak nggunakake umi_tools (v1.0.1). Pungkasan, penghitungan alignment ditindakake nggunakake featureCounts ing Subread (v2.0.3). Kontrol kualitas ditindakake nggunakake FastQC (v0.11.9) ing sawetara tahapan menengah pipa.
Kabeh pangolahan lan visualisasi bioinformatika luwih lanjut ditindakake ing R (v4.2.3), utamane nggunakake alur kerja Seurat (v4.4.0). 83 Mulane, nilai UMI individu lan matriks metadata diowahi dadi obyek Seurat. Gen sing diekspresikan ing kurang saka 30% saka kabeh serat dibusak. Sampel kualitas rendah dibusak adhedhasar ambang minimal 1000 nilai UMI lan 1000 gen sing dideteksi. Pungkasane, 925 serat ngliwati kabeh langkah penyaringan kontrol kualitas. Nilai UMI dinormalisasi nggunakake metode Seurat SCTransform v2, 84 kalebu kabeh 7418 fitur sing dideteksi, lan bedane antarane peserta diregresi. Kabeh metadata sing relevan bisa ditemokake ing Dataset Tambahan 28.